罕見的凍屍：這具在俄羅斯發現的非常罕見的小長毛像凍屍距今已有42 000年，包含大量有用的信息。不過，想要了解這種動物曾經賴以生存的生物機能的精確細節，只能依靠DNA。
生物技術的發展使我們能夠重新構建滅絕動物的古基因，並進而研究古生物機體活著的時候如何運轉。利用這種方法，科學家揭開了史前巨獸長毛像如何適應冰河時代嚴酷環境的謎題。
撰文 凱文•L•坎貝爾(Kevin L. Campbell) 邁克爾•霍夫瑞特(Michael Hofreiter)翻譯 黃修遠 李輝
150多年以來，科學家一直主要依靠骨骼和牙齒化石，來重塑史前生物。骨架能夠告訴科學家這些古生物的體型大小和身體形態；骨骼上的肌肉附著點顯示了這些生物究竟有多麼強壯，以及它們可能的移動方式；牙齒形狀和磨損程度則揭示了它們的食物種類。總而言之，研究者們必須想方設法從這些堅硬的化石中獲取大量的信息。在某些偶然的情況下，他們會有機會獲得保存完好的干屍或者凍屍。這使得研究者們能夠得到更多細節用以重塑，例如毛發的長度、耳朵的形狀、動物最後一頓晚餐所吃的東西等等。盡管科學家已經能夠推斷過去生命體的物理特征，但對於維持它們生存的生理活動，我們卻知之甚少。
不過，這個空白正在逐漸填補。生物技術的最新發展已經使得我們有辦法重新構建滅絕動物的古基因，並進而復原這些基因所編碼的蛋白質——這些蛋白質組成並驅動的細胞機器，構成了這些動物生命活動的基矗這項工作預示著一個令人激動的新科學領域即將誕生：古生理學(paleophysiology)。這一學科將研究古生物機體在活著的時候如何運轉。雖然我們在這一領域的研究才剛剛開始，但是我們已經有了出色的成果。我們已經了解了一種具有代表性的史前巨獸——長毛像(woolly mammoth)——是如何適應冰河時代嚴酷的生存環境的。雖然要像電影《侏羅紀公園》中所描繪的那樣，從史前動物的遺骸中將它們克隆出來依舊遙不可及；但我們的工作證明，對於那些早已從地球表面消失了的生物，我們現在已經有辦法去了解曾經在它們體內發生過的一些關鍵生理活動。
冷凍樣本
這個想法來源於坎貝爾。2001年的一個夜晚，當時他正在觀看一檔紀實節目，節目所拍攝的是從西伯利亞凍土層中挖掘出的完整長毛像遺海由於當時媒體正在鋪天蓋地對1997年的克隆羊多利進行宣傳，節目中的專家推測(事後證明是錯誤的)，通過從長毛像體內提取DNA，科學家也許很快就能使這種生物重現於世。與這個過於宏大而且復雜的計劃相比，坎貝爾的想法目的更加明確，也更具有可行性。他想要知道，這種亞洲像的古代親戚是如何適應高緯度寒冷氣候的。
化石記錄顯示，長毛像的祖先全都起源於非洲的亞熱帶平原，而它們遷徙到西伯利亞地區只不過是在距今不到200萬年前。當時，地球剛剛進入歷史上最為寒冷的時期之一：更新世冰河時代(Pleistocene ice ages)。就像非洲像一樣，長毛像的祖先在它們故鄉所面臨的最大生理問題是如何避免身體過熱。可是，當這一支長毛像遷徙到北方時，由於環境溫度下降，保持體溫變成了最為重要的事情。
我們對於滅絕物種相關的生物學知識，都來自對其化石、凍屍或者干屍的詳細研究，因此，對於長毛像如何適應寒冷環境的討論，主要局限於那些能夠從復原屍體上直接觀察到的物理性質，比如，長毛像的名稱來自那些又厚又長的體毛。物理特征只是這個故事的一部分，而且很可能是非常小的一部分。事實上毫無疑問的是，必定有一系列生理功能對於它們在寒冷環境中的生存而言至關重要。不幸的是，這些生理活動沒有在化石記錄中留下任何痕跡，因此，我們唯一的希望就是去研究那些從化石中提取出來的破碎的DNA小片段。利用這些基因片段拼湊出一段完整的基因，並將它們植入活細胞中，誘導這些細胞產生那些曾經控制過這些生理活動的蛋白質。然後，我們通過與這些滅絕動物的現代近親作比較，來仔細研究這些蛋白質是如何在它們體內運轉的。
雖然相比起讓巨獸復生，坎貝爾所提出的用古DNA研究長毛像如何適應寒冷環境這一想法要簡單很多，但是仍然還有很多高難度、基礎性的生物技術工作需要去做。幸運的是，這方面的古DNA研究有了很大的進展，為實現這一目標鋪平了道路。
不管保存環境如何理想，在死亡很久的樣品體內，存留DNA的量都是非常少的。而且，由於化學損傷，DNA會高度片段化，顯得支離破碎。在活著的生物體內，存在兩種DNA：一種是簡單的環狀DNA，存在於產生能量的細胞器——線粒體中；另一種則更為復雜，它們存在於細胞核中。早期關於古DNA的研究都集中在線粒體DNA上，因為它們遠比核DNA豐富得多：每個細胞擁有上百個線粒體，但卻只有一個細胞核。可是，線粒體DNA在一個細胞全部的遺傳物質中只占非常小的一部分，它們所編碼的蛋白質也屈指可數，而且都僅用於線粒體內。真正重要的是核DNA。科學家一開始認為，不可能獲得足夠的核DNA用於研究已經滅絕的古生物。然而在1999年，阿萊克斯•格林伍德(Alex Greenwood，現任職於德國柏林的萊布尼茨研究院，負責動物學和野生動物研究)及其同事發表文章稱，他們發現的證據表明，在凍土層中的遺骸裡所包含的核DNA小片段能夠保存數萬年之久，並且其數量足夠用於科學分析。
盡管格林伍德的研究表明，從長毛像這樣的古老生物體內獲取小片段的核DNA序列(最多擁有70個核苷酸)是可能的，但是，每一個完整基因都是由成百上千個核苷酸組成的，要確定完整基因的序列仍然是很不現實的。而且，格林伍德的方法會給很多好不容易才獲得的古DNA造成損傷。不過，霍夫瑞特找到了解決這一問題的方法。他借用了一種叫做多重PCR的技術，分子生物學家經常用這一技術從現存生物體內獲得多重DNA拷貝。這使得我們在研究滅絕生物體生理機能的道路上掃清了一個極其關鍵的障礙。這一實驗技術可用於古DNA研究的首個證據，便是霍夫瑞特於2005年所發表的研究成果。他的研究團隊首次成功地組裝出一頭冰河時代長毛像的完整線粒體基因組(16 500個核苷酸序列)。
金毛與紅毛
在改進了古DNA測序技術之後，霍夫瑞特的團隊開始在德國萊比錫重建第一段完整的滅絕物種核基因。這次研究所使用的DNA也是來源於一頭長毛像。他們從一塊保存非常完好的長毛像股骨中提取了DNA。這塊股骨距今43 000年，發現於西伯利亞的大松雞河(Great Grouse River)。研究者們選擇了黑皮質素1受體(melanocortin 1 receptor ，縮寫是MC1R)基因作為研究對像，人們認為這段基因決定了鳥類羽毛顏色與哺乳動物毛發顏色。研究者們之所以選擇MC1R，是因為它的長度很短，而且很容易插入到用來檢測其活性的細胞中。這就使得研究人員可以將DNA序列與可觀察的表型聯系在一起。
由於從凍土保存的長毛像凍屍上復原得到的毛發，既有淺色的，也有深色的，於是，霍夫瑞特及其同事推測，這兩種不同的毛發顏色可能就是由於長毛像所擁有的基因不同而造成的，而不是這些毛發在數萬年間所接觸到的那些化學沉積物導致的。他們對MC1R基因所包含的全部1 236個核苷酸進行了完整的測序，發現有兩種不同的基因類型(即等位基因)。他們發現，與非洲像中對應的基因相比，第一種等位基因有一個核苷酸不同，而第二種等位基因則在另外三個位點上也發生了突變。這些突變都會導致其所編碼的蛋白質中氨基酸(蛋白質的組成元件)發生改變。
讓霍夫瑞特及其同事感到很興奮的是，他們發現這些氨基酸發生了改變的位置中，有兩處在進化過程中很少發生改變，但由於其他哺乳動物中缺少可以進行比對的突變，因此他們無法判斷這些不常見的氨基酸改變是否會影響到長毛像的毛色。不過，進一步的分析發現，第二種等位基因的三個突變中，有一個突變會導致色素沉著基因活性降低。通過參考其他哺乳動物中色素沉著基因的分子活性，研究者們認為，這個弱化突變可能是導致一些長毛像的毛色變為金色的原因。
非常巧合的是，在美國加利福尼亞大學聖地亞哥分校工作的霍匹•福斯查(Hopi Hoekstra)及其同事也同時發現，現存的白額白足鼠某些種群中存在一種MC1R基因的變異。這種變異與在長毛像第二種等位基因中發現的突變一樣，會導致同一個關鍵的氨基酸被替換掉。更為重要的是，帶有這種突變的白額白足鼠毛色為淺色。在沙地環境中，這種淺色毛發為它們提供了一種天然的保護色。然而，長毛像能從這種淺色毛發中獲得什麼優勢，現在還不是很清楚，因為在遠古的西伯利亞，即使是金色毛發的個體在那片寸草不生的土地上依舊會顯得很顯眼。不過，可以想像的是，這種較淺的毛皮能夠幫助這些動物在寒冷多風的環境裡保持溫暖。這已經在現存的淺色鳥類和哺乳動物中得到證實。雖然這聽起來很違反常理，因為淺色毛發會反射很多太陽輻射，但是這些毛發也同樣能夠零星地將一些輻射分散給皮膚，在那裡這些輻射將被吸收而轉換為熱量。相比之下，深色毛發只會將太陽輻射吸收到它的表面，而這些熱量很快就會被大風吹散。
在成功地重構出長毛像的核基因之後，霍夫瑞特的團隊將注意力集中到了尼安德特人(Neandertals)身上。尼安德特人是智人(Homo sapiens)的近親，曾經生活在歐亞大陸上，在距今約28 000年前滅絕。霍夫瑞特的團隊獲得了一段由128個核苷酸組成的MC1R基因片段，其所編碼的氨基酸替換在現代人類中並不存在。同長毛像的等位基因一樣，分析表明這個替換會使其編碼的蛋白質的活性比標准現代人的更低。在現代歐洲人中，MC1R的突變也同樣導致了類似的蛋白質活性下降，使得這些人的毛發變為紅色，皮膚變白，因此，我們推測，一部分尼安德特人可能也擁有紅色頭發和白色皮膚(雖然其蛋白質活性下降是由另一種突變造成的)。尼安德特人生活在高緯度地區，在那裡，用於合成維生素D的紫外線非常稀少。由於紫外線不太容易穿透深色肌膚，因此白皙的肌膚可能有利於尼安德特人吸收足夠的紫外線。
這些開創性的研究明確證實，可見表型的基因重現如今是可行的。我們現在准備用這些有力的新工具，去研究滅絕物種的生活過程——這是真正的古生理學。
戰勝寒冷
無論是馴鹿還是麝牛，所有這些適應寒冷環境的大型哺乳動物都擁有一個密集的動脈和靜脈系統：動脈血管和靜脈血管擠在一起，兩者血流方向相反，不停地流淌在四肢和手足之間。這種結構通常被稱為細脈網(rete mirabile)，或者“神奇網絡”(wonderful net)，這是一種高效的反向熱交換結構。溫熱、含氧的動脈血從身體中心流出，將自己大部分的熱量轉移給返回心髒的較冷的靜脈血。這樣兩者之間便形成熱量梯度，使腳掌這類接觸寒冷表面的器官能夠將溫度保持在0攝氏度左右。這樣，需要額外的熱量來溫暖手足的情況就大大減少了。當冬天來臨，很難從外界獲得熱量時，這一點對極地動物來說就很有優勢了。不過，這種生理上的適應卻使得手足部失去了用於維持血紅蛋白正常工作的熱能。在脊椎動物中，紅細胞中的血紅蛋白從肺部獲取氧氣，並將它們運送到組織裡。因為切斷血紅蛋白與氧氣之間的弱化學鍵時需要能量，因此，當溫度下降時，血紅細胞的輸氧能力就會下降。
為了彌補這個缺陷，這些在寒冷地帶生活的哺乳動物需要輔助熱源，給血紅蛋白提供熱量。雖然這一過程的精確分子機制尚不明確，但是一般都涉及到紅細胞中的其他分子與血紅蛋白的結合。這些分子與血紅蛋白形成化學鍵時便會釋放熱能，從而幫助血紅蛋白將氧氣釋放到組織中。
在還沒有與霍夫瑞特的團隊合作之前，坎貝爾的團隊就認為，長毛像的血紅蛋白也可能進化出了類似的機制，用來在寒冷環境中促進氧氣釋放。對長毛像的血紅蛋白基因進行測序，並將其與亞洲像的血紅蛋白基因進行對比，可能會有助於揭示是否存在類似的機制，並且了解這種機制具體是什麼樣。
坎貝爾最早與澳大利亞阿德萊德大學的阿蘭•庫珀(Alan Cooper)進行了合作，並對兩段長毛像基因進行了測序。這兩段基因用於產生兩種不同的球蛋白肽鏈，它們是組成血紅蛋白的主要成分。在合作中，研究團隊遇到的主要困難是：他們手上大多數的長毛像樣本質量都不太好，以至於無法提取到足夠量的可用DNA片段。這時，霍夫瑞特的團隊加入了進來，並且采用了與提取MC1R基因相同的技術。很快，我們就得到了這兩種長毛像血紅蛋白基因的完整序列，並由此了解到球蛋白肽鏈的氨基酸序列。
第一批DNA測序結果顯示，在146個氨基酸位點中，長毛像的球蛋白肽鏈與亞洲像的相比，有三個位點存在不同。這一發現讓我們興奮不已，因為我們確信，在這三個被替換的氨基酸中，一定包含著與長毛像在生理活動層面適應寒冷環境有關的基因特征。支持我們這個猜測的最初證據來源於一個罕見的人類血紅蛋白變異。這種被稱為拉什血紅蛋白(hemoglobin Rush)的變異中，有一個突變與在長毛像序列中發現的一樣。雖然，拉什血紅蛋白與正常人的血紅蛋白相比只有一個氨基酸位點的差異，但是這種差異卻完全改變了這種血紅蛋白的生物化學性質。這一突變使得血紅蛋白對溫度的敏感性顯著下降，從而在寒冷環境中更容易釋放氧氣。在那些適應寒冷環境的哺乳動物體內，血紅蛋白也是這樣運作的。
為了進一步弄清楚那些在長毛像血紅蛋白中發現的變異是否與適應寒冷氣候有關，我們著手復原古血紅蛋白，並觀察它如何工作。為了能夠復制編碼長毛像血紅蛋白各條肽鏈的基因，我們獲取了完整的亞洲像血紅蛋白基因，並改變了那三個突變位置，使之與長毛像的序列一致。然後，我們將這樣得到的類長毛像基因插入大腸杆菌中，誘導它們合成並組裝出長毛像的血紅蛋白。與那些曾經流淌在43 000年前長毛像血液中的血紅蛋白相比，這些人工誘導產生的血紅蛋白無論從結構還是功能上，都達到了以假亂真的地步。
有史以來，我們是第一批站在這個令人羨慕的位置上的人。我們能准確地對一種滅絕物種的重要生理活動進行分析，就像我們研究現存動物的生理活動一樣。我們模擬了紅細胞內的化學環境，測量了在各種生理溫度下，長毛像血紅蛋白和現代像血紅蛋白各自結合氧氣及釋放氧氣的能力。正如我們在拉什血紅蛋白的研究中所預測的那樣，在低溫下，長毛像的血紅蛋白確實比亞洲像的血紅蛋白更容易釋放氧氣(當溫度維持在大像正常的核心體溫，即約37攝氏度時，兩種血紅蛋白結合氧氣和釋放氧氣的能力相同)。有趣的是，雖然長毛像的血紅蛋白也是依靠結合其他分子來獲取額外熱量，從而提升其運送氧氣的有效負荷，但是幫助實現這一功能的突變基因卻與現代極地動物體內的那些完全不同。這一結果是通過比較兩者相關基因序列而發現的。這也就能夠解釋，為什麼長毛像的突變能夠幫助它們適應寒冷環境，而在人體中的拉什變異卻沒有類似的效果，因為拉什變異會導致血紅蛋白不穩定，並進而使其攜帶者患上慢性貧血症。至於為什麼這種不受歡迎的變異會出現在人類中，而沒有出現在長毛像中，這還需要進一步研究來解答。
復活長毛像？
當然，血紅蛋白的適應性變化只是長毛像適應寒冷環境的冰山一角，它們演化出來的很多其他生物化學適應機制還有待闡明。更何況，除了長毛像之外，還有幾十種其他滅絕物種的適應機制也尚不明晰。不幸的是，近些年來，科學家通過測序所得到的大量古基因組好像對這項研究沒有太大幫助。因為這種用鳥槍法測序技術得到的序列會有隨機混合的現像存在，雖然對於宏觀分析很有用，但是對於研究生理機制來說卻顯得不夠精確和完整。雖然多次重復測序能夠解決這一問題，但資金消耗卻非常龐大。
一種名為雜交捕獲(hybridization capture)的新技術，能夠以更低的價格來更好地覆蓋目標基因。這可能有助於解決這個問題，並使我們有可能通過大規模的研究，來比較西伯利亞長毛像的重要基因網絡在溫暖的間冰期和寒冷的盛冰期之間有什麼區別。通過雜交捕獲，研究者們還能比較同一物種在地理分布上不同的兩個群體——比如西伯利亞長毛像和哥倫比亞長毛像。這些研究不僅能使我們分析種內的基因差異，而且也有可能使我們發現它們為了適應當地的地理與氣候條件而形成的新生理機制。雖然這樣的未來讓人非常興奮(想像一下，過去五萬年的進化歷程將在你的眼前展開)，但是我們分析古生理學的能力實際上非常有限。理想的情況是，我們能夠在生物體內研究那些滅絕了的蛋白質。因為，蛋白質的很多性質都只有在活體中才能觀察到。可是，短期內我們卻沒有辦法實現這種研究，因為這需要讓滅絕物種復活過來。
到目前為止，我們只能讓自己滿足於在試管和人工培養的細胞中觀察古蛋白。我們已經著手運用這些技術，去研究其他滅絕生物的生理活動，包括乳齒像(mastodon)以及不久之前剛剛滅絕的極地海洋哺乳動物——史德拉海牛(Steller’s sea cow)。不得不說，要克隆這些動物是一項極為復雜的工作，即使在不遠的將來，這一切也應該只能存在於幻想之中。同時，我們將會繼續一個蛋白質接著一個蛋白質地來賦予這些早已從世界上消失了的野獸們以生命。
本文作者
凱文•L•坎貝爾是加拿大馬尼托巴大學的環境與進化生理學教授。他的研究方向是現存哺乳動物的血紅蛋白，以及滅絕哺乳動物蛋白的性質和進化。
邁克爾•霍夫瑞特是英國約克大學的生物學教授。他通過分析古DNA的序列，來研究動物如何應對環境變化。
本文譯者
李輝是復旦大學生命科學學院人類學系的教授、博士生導師；黃修遠是李輝教授的研究生。